厌氧菌的实验分离方法及流程

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厌氧菌的分离培养主要分初代培养和次代培养两个阶段，其中初代培养相对比较困难，关键的问题就是厌氧环境和培养基的选择。

　　初代培养的一般原则是：

　　（1）先将标本涂片染色直接镜检，指导培养基的选择。

　　（2）尽量选用在厌氧菌中覆盖面宽的非选择性培养基。

　　（3）最好多选1～2种覆盖面不同的选择性培养基。

　　（4）尽量保证培养基新鲜。

　　（5）要考虑到微需氧菌存在的可能医.学教育网搜集整理。

　　1.选用适当的培养基接种：应接种固体和液体两种培养基；

　　（1）培养基的使用，应注意下列各点：

　　1）尽量使用新鲜培养基，2～4h内用完；

　　2）应使用预还原培养基，预还原24～48h更好；

　　3）可采用预还原灭菌法制作的培养基（用前于培养基中加入还原剂，如L-半胱氨酸、硫乙醇酸钠、维生素C及葡萄糖等，尽可能使预还原剂处于还原状态）；

　　4）液体培养基应煮沸10min，以驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种医.学教育网搜集整理；

　　5）培养厌氧菌的培养基均应营养丰富，并加有还原剂与生长刺激因子（血清、维生素K、氯化血红素、聚山梨酯-80等）。

　　（2）培养基的选择：初次培养一般都使用选择培养基和非选择培养基。

　　1）非选择培养基：本培养基使分离的厌氧菌不被抑制，几乎能培养出所有的厌氧菌。常使用心脑浸液琼脂（BHI）、布氏琼脂（BR）、胰豆胨肝粉琼脂（GAM）、胰胨酵母琼脂（EG）、CDC厌氧血琼脂等。

　　2）选择培养基：为有目的选择常见厌氧菌株，以便尽快确定厌氧的种类。

　　2.每份标本至少接种3个血平板，分别置于有氧，无氧及5%～10à2环境中培养，以便正确地培养出病原菌，从而判断其为需氧菌、兼性厌氧菌、微需氧菌或厌氧菌中的哪一类。
　
　　3.厌氧培养法
　
　　（1）厌氧罐培养法。
　
　　（2）气袋法医.学教育网搜集整理。
　
　　（3）气体喷射法：又称转管法。
　
　　（4）厌氧手套箱培养法：是迄今厌氧菌培养的最佳仪器之一。
　
　　（5）其他培养法：平板焦性没食子酸法；生物耗氧法；高层琼脂培养法。
　
　　4.厌氧状态的指示：美蓝和刃天青。无氧时均呈白色，有氧时美蓝呈蓝色，刃天青呈粉红色。
　
　　5.分离培养厌氧菌失败的原因：①培养前未直接涂片和染色镜检；②标本在空气中放置太久或接种的操作时间过长；③未用新鲜配制的培养基；④未用选择培养基；⑤培养基未加必要的补充物质；⑥初代培养应用了硫乙醇酸钠作为唯一厌氧菌培养基；⑦无合适的厌氧罐或厌氧装置漏气；⑧催化剂失活；⑨培养时间不足；⑩厌氧菌的鉴定材料有问题。

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1.分离厌氧菌主要是培养基的无氧状态必须达到细菌需求，煮沸趋氧，同时加入还原剂降低ORP；也可以配好的培养基充氮气一小时达到厌氧状态。产甲烷菌需要的氧化还原电位在-300mv以上才生长良好，至少也要-200mv，刃天青无色指示的氧化还原电位约在-110mv。结晶紫可以指示更低一些。只是我没这么用过。
2.厌氧菌分离，也可以用好氧菌的划线法进行。产甲烷菌生长缓慢，需要耐心等待。
3.仪器问题，最好用可灭菌的厌氧箱，国内上海跃进有一款，几万元，只是质量不太好。进口20万约。如果经费限制可以先根据现有的厌氧箱的模式，制作一个简易封闭的有机玻璃箱子，用大塑料袋充氮气，排除空气，来置换，安装一个紫外灯。
4.如果有些厌氧操作的基础，也可以用滚管法分离。只需要厌氧管和无氧培养基就可以了，不需要特别的仪器，只要灭菌锅，氮气瓶，常规恒温培养箱就可以。江苏海门有卖厌氧管的。
5.操作起来比较麻烦，简要说说，仅供参考。

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沼气和生物质气化是两个完全不同的概念，生物质气化是秸秆或木屑在不完全燃烧或干馏状态下生成可燃气体，属于生物质的热化学反应，沼气是有机质在厌氧条件下通过厌氧细菌（产甲烷菌）作用形成以甲烷和二氧化碳为主要成分的可燃气体。生物质气化由于诸多原因现在搞的人不多了，沼气发酵是现在的研究热点，但产业不行，做做实验发论文足以，如果靠此就业就不能说前途很好了。但这个行业的未来前景是美好的。

我，依然是我

尽快找到突破点

wusword668

楼主说的在理，我赞同你的做法，可惜我很多次都是以失败告终

weizhoulia

zhj0072

学习一下

chutianshu

谢谢分享

zhj0075

学习了

zhj0075

学习了